ابزار جدید مبتنی بر CRISPR می‌تواند ژن‌های معیوب را حذف کرده و آن‌ها را با ژن‌های جدید جایگزین کند

محققان MIT با تکیه بر سیستم ویرایش ژن CRISPR ابزار جدیدی طراحی کرده اند که می تواند ژن های معیوب را جدا کرده و آنها را با ژن های جدید به روشی ایمن تر و کارآمدتر جایگزین کند.

با استفاده از این سیستم، محققان نشان دادند که می‌توانند ژن‌هایی را تا 36000 جفت باز DNA به چندین نوع سلول انسانی و همچنین به سلول‌های کبد در موش تحویل دهند. این تکنیک جدید که با نام PASTE شناخته می‌شود، می‌تواند برای درمان بیماری‌هایی که توسط ژن‌های معیوب با تعداد زیادی جهش ایجاد می‌شوند، مانند فیبروز کیستیک، نویدبخش باشد.

این یک روش ژنتیکی جدید برای هدف قرار دادن این بیماری‌های واقعاً سخت است. ما می‌خواستیم روی کاری که قرار بود ژن‌درمانی در آغاز اولیه‌اش انجام دهد، یعنی جایگزینی ژن‌ها، نه فقط اصلاح جهش‌های فردی، کار کنیم.»

عمر ابودایه، عضو مک گاورن در موسسه تحقیقات مغز مک گاورن MIT

ابزار جدید هدف‌گیری دقیق CRISPR-Cas9، مجموعه‌ای از مولکول‌های مشتق شده از سیستم‌های دفاعی باکتریایی را با آنزیم‌هایی به نام اینتگراز ترکیب می‌کند که ویروس‌ها از آن برای وارد کردن مواد ژنتیکی خود در ژنوم باکتری استفاده می‌کنند.

جاناتان گوتنبرگ، همکار مک گاورن، می‌گوید: «درست مانند CRISPR، این اینتگرازها از نبرد مداوم بین باکتری‌ها و ویروس‌هایی که آنها را آلوده می‌کنند به دست می‌آیند. این نشان می‌دهد که چگونه می‌توانیم به یافتن فراوانی ابزارهای جدید جالب و مفید از این سیستم‌های طبیعی ادامه دهیم.»

گوتنبرگ و ابودایه نویسندگان ارشد این مطالعه جدید هستند که امروز در سال 2018 منتشر شده است بیوتکنولوژی طبیعت. نویسندگان اصلی این مطالعه، همکاران فنی MIT متیو یارنال و روهان کراجسکی، دانشجوی سابق کارشناسی ارشد MIT، Eleonora Ioannidi، و دانشجوی کارشناسی ارشد MIT Cian Schmitt-Ulms هستند.

درج DNA

سیستم ویرایش ژن CRISPR-Cas9 از یک آنزیم برش دهنده DNA به نام Cas9 و یک رشته RNA کوتاه تشکیل شده است که آنزیم را به ناحیه خاصی از ژنوم هدایت می کند و Cas9 را به کجا هدایت می کند تا برش خود را انجام دهد. هنگامی که Cas9 و RNA راهنما که یک ژن بیماری را هدف قرار می دهد به سلول ها تحویل داده می شود، برش خاصی در ژنوم ایجاد می شود و فرآیندهای ترمیم DNA سلول ها برش را دوباره به هم می چسباند و اغلب بخش کوچکی از ژنوم را حذف می کند.

اگر یک الگوی DNA نیز تحویل داده شود، سلول ها می توانند یک نسخه اصلاح شده را در طول فرآیند ترمیم در ژنوم خود بگنجانند. با این حال، این فرآیند به سلول‌ها نیاز دارد که شکستگی‌های دو رشته‌ای در DNA خود ایجاد کنند، که می‌تواند باعث حذف کروموزومی یا بازآرایی‌هایی شود که برای سلول‌ها مضر است. محدودیت دیگر این است که فقط در سلول‌هایی که در حال تقسیم هستند کار می‌کند، زیرا سلول‌های غیرقابل تقسیم فرآیندهای ترمیم DNA فعالی ندارند.

تیم MIT می خواست ابزاری بسازد که بتواند یک ژن معیوب را قطع کند و آن را با ژن جدید جایگزین کند، بدون اینکه باعث شکسته شدن DNA دو رشته ای شود. برای رسیدن به این هدف، آنها به خانواده ای از آنزیم ها به نام اینتگرازها روی آوردند که ویروس هایی به نام باکتریوفاژها از آنها برای وارد کردن خود به ژنوم باکتری ها استفاده می کنند.

برای این مطالعه، محققان بر روی اینتگرازهای سرین تمرکز کردند که می‌توانند تکه‌های عظیمی از DNA را به بزرگی 50000 جفت باز وارد کنند. این آنزیم‌ها توالی‌های ژنوم خاصی را که به عنوان مکان‌های اتصال شناخته می‌شوند، هدف قرار می‌دهند که به عنوان «صفحه‌های فرود» عمل می‌کنند. هنگامی که آنها سکوی فرود صحیح را در ژنوم میزبان پیدا می کنند، به آن متصل می شوند و محموله DNA خود را یکپارچه می کنند.

در کار گذشته، دانشمندان دریافتند که توسعه این آنزیم‌ها برای درمان انسانی چالش برانگیز است، زیرا سکوهای فرود بسیار خاص هستند و برنامه‌ریزی مجدد اینتگرازها برای هدف قرار دادن مکان‌های دیگر دشوار است. تیم MIT متوجه شد که ترکیب این آنزیم‌ها با یک سیستم CRISPR-Cas9 که محل فرود صحیح را وارد می‌کند، برنامه‌ریزی مجدد سیستم قدرتمند درج را ممکن می‌سازد.

ابزار جدید، PASTE (افزودن قابل برنامه‌ریزی از طریق عناصر هدف‌گذاری خاص سایت)، شامل یک آنزیم Cas9 است که در یک مکان ژنومی خاص، توسط رشته‌ای از RNA که به آن محل متصل می‌شود، برش می‌دهد. این به آنها اجازه می دهد تا هر مکان در ژنوم را برای درج محل فرود، که شامل 46 جفت باز DNA است، هدف قرار دهند. این درج را می توان بدون ایجاد هرگونه شکست دو رشته ای با افزودن یک رشته DNA ابتدا از طریق یک رونوشت معکوس ذوب شده و سپس رشته مکمل آن انجام داد.

هنگامی که محل فرود گنجانده شد، اینتگراز می تواند همراه شود و محموله DNA بسیار بزرگتر خود را در ژنوم آن مکان وارد کند.

گوتنبرگ می‌گوید: «ما فکر می‌کنیم که این گام بزرگی در جهت دستیابی به رویای درج DNA قابل برنامه‌ریزی است. این تکنیکی است که به راحتی می‌توان آن را هم با سایتی که می‌خواهیم ادغام کنیم و هم برای محموله تنظیم کرد.»

جایگزینی ژن

در این مطالعه، محققان نشان دادند که می‌توانند از PASTE برای وارد کردن ژن در چندین نوع سلول انسانی، از جمله سلول‌های کبد، سلول‌های T و لنفوبلاست‌ها (گلبول‌های سفید نابالغ) استفاده کنند. آنها سیستم تحویل را با 13 ژن محموله مختلف، از جمله برخی که می توانند از نظر درمانی مفید باشند، آزمایش کردند و توانستند آنها را در 9 مکان مختلف در ژنوم قرار دهند.

در این سلول‌ها، محققان توانستند ژن‌هایی را با موفقیت بین 5 تا 60 درصد وارد کنند. این رویکرد همچنین تعداد بسیار کمی «indels» ناخواسته (درج یا حذف) در محل ادغام ژن به همراه داشت.

ابودایه می‌گوید: «ما تعداد کمی از ایندل‌ها را می‌بینیم، و از آنجایی که شکستگی‌های دو رشته‌ای انجام نمی‌دهیم، لازم نیست نگران بازآرایی‌های کروموزومی یا حذف‌های بازوی کروموزومی در مقیاس بزرگ باشید».

محققان همچنین نشان دادند که می‌توانند ژن‌ها را در کبد «انسان‌شده» موش‌ها وارد کنند. کبد این موش ها از حدود 70 درصد سلول های کبدی انسان تشکیل شده است و PASTE با موفقیت ژن های جدید را در حدود 2.5 درصد از این سلول ها ادغام کرد.

توالی های DNA که محققان در این مطالعه وارد کردند تا 36000 جفت باز طول داشتند، اما آنها معتقدند که توالی های طولانی تر نیز می توانند استفاده شوند. یک ژن انسانی می تواند از چند صد تا بیش از 2 میلیون جفت باز متغیر باشد، اگرچه برای اهداف درمانی فقط باید از توالی کد کننده پروتئین استفاده شود که به شدت اندازه بخش DNA را که باید در ژنوم وارد شود کاهش می دهد.

محققان اکنون در حال بررسی بیشتر امکان استفاده از این ابزار به عنوان راهی ممکن برای جایگزینی ژن معیوب سیستیک فیبروزیس هستند. این تکنیک همچنین می‌تواند برای درمان بیماری‌های خونی ناشی از ژن‌های معیوب، مانند هموفیلی و کمبود G6PD، یا بیماری هانتینگتون، یک اختلال عصبی ناشی از یک ژن معیوب که تکرار ژن‌های زیادی دارد، مفید باشد.

محققان همچنین ساختارهای ژنتیکی خود را به صورت آنلاین برای سایر دانشمندان در دسترس قرار داده اند تا از آنها استفاده کنند.

گوتنبرگ می‌گوید: «یکی از چیزهای خارق‌العاده در مورد مهندسی این فناوری‌های مولکولی این است که مردم می‌توانند بر روی آن‌ها بسازند، توسعه دهند و به روش‌هایی استفاده کنند که شاید ما فکرش را نمی‌کردیم یا در نظر نداشتیم.» “این واقعا عالی است که بخشی از آن جامعه در حال ظهور باشید.”

این تحقیق توسط بنیاد ملی علوم سوئیس پسادکتر تحرک، مؤسسه ملی بهداشت، برنامه فناوری اعصاب مؤسسه مک گاورن، مرکز درمان مولکولی K. Lisa Yang و Hock E. Tan در علوم اعصاب، G. Harold و Leila Y تامین شد. بنیاد خیریه Mathers، MIT John W. Jarve Seed Fund for Science Innovation، Impetus Grants، یک بنیاد پیشگام فیبروز کیستیک، Google Ventures، Fast Grants، و موسسه McGovern.