بررسی یک استراتژی جدید توالی یابی ویروس mpox مبتنی بر آمپلیکون

یافته‌های مطالعه پوشش ژنومی معادل آمپلیکون و توالی‌یابی متاژنومی را در نمونه‌های با Ct پایین (کمتر از 18)، اما پوشش ژنومی با استفاده از توالی‌یابی آمپلیکون در نمونه‌هایی با Ct بالاتر به‌طور قابل‌توجهی بیشتر یافت. این نتایج اولیه نشان داد که روش‌های توالی‌یابی مبتنی بر آمپلیکون می‌تواند پوشش ژنوم ژنوم‌های mpox انسانی با سطوح Ct بالاتر استخراج‌شده از نمونه‌های بالینی، به ویژه در مقادیر Ct بالاتر را افزایش دهد. این تیم خاطرنشان کرد که ژنوم های تقریباً کامل را می توان به طور موثر از سواب های اوروفارنکس با یا بدون وجود ضایعات توالی یابی کرد. این نشان داد که سواب های ضایعه و همچنین سواب های اوروفارنکس ممکن است به عنوان نمونه های توالی یابی عمل کنند.

برای ارزیابی بیشتر استراتژی پرایمر، 145 نمونه بالینی اضافی در دو آزمایشگاه جداگانه تعیین توالی شدند. در مجموع 115 سواب ضایعه و هشت سواب اوروفارنکس در MASPHL پردازش شدند، در حالی که 22 سواب ضایعه برای تعیین توالی در دانشکده بهداشت عمومی ییل (YSPH) پردازش شدند.

اپیدمی چند کشوری mpox در سال 2022، که مصادف با ادامه بیماری کروناویروس 2019 (COVID-19) بود، بر ضرورت پایش ژنومی و توالی یابی سریع کل ژنوم پاتوژن تاکید کرد. بسیاری از عفونت‌های اولیه mpox با استفاده از تکنیک‌های توالی‌یابی متاژنومیک توالی‌یابی شده‌اند. با این حال، این روش‌ها به منابع فشرده نیاز دارند و به نمونه‌هایی نیاز دارند که حاوی سطوح بالای اسید دئوکسی ریبونوکلئیک ویروسی (DNA) باشد. با توجه به تظاهرات بالینی منحصر به فرد افراد مرتبط با اپیدمی و ابهام پیرامون بار ویروسی در سراسر دوره عفونت و همچنین نواحی آناتومیکی بدن، تقاضای فوری برای یک تکنیک توالی یابی حساس تر و گسترده تر وجود دارد.

در مورد مطالعه

در مطالعه اخیر ارسال شده به medRxiv* سرور پیش چاپ، محققان توسعه یک استراتژی توالی بر اساس آمپلیکون ها برای تشخیص mpox را توصیف کردند.

زمینه

به طور کلی، یافته‌های مطالعه نشان داد که توالی‌یابی مبتنی بر آمپلیکون می‌تواند حساسیت، عمق و وسعت پوشش ژنومی ویروس mpox انسانی را حتی زمانی که نمونه‌های با غلظت کم DNA استفاده می‌شود، بهبود بخشد. از طریق توانایی “وصل کردن” طرح پرایمر ویروسی mpox انسانی به زیرساخت توالی‌یابی فعلی، روش حاضر می‌تواند آزمایشگاه‌های بهداشت عمومی در سراسر جهان را قادر سازد تا به سرعت رویه‌های موجود خود را در پاسخ به همه‌گیری جهانی mpox تنظیم کنند.

*اطلاعیه مهم

منبع

در مطالعه حاضر، محققان از PrimalScheme برای توسعه پرایمرهای ویروس mpox انسانی در تکنیک های توالی یابی مبتنی بر آمپلیکون استفاده کردند.

این مطالعه همچنین نشان داد که کاهش مقدار کل توالی‌خوانی‌ها به 0.5 میلیون از دو میلیون، آستانه پوشش 80 درصدی Ct را کاهش می‌دهد که منجر به کاهش 7.2 درصدی پوشش ژنوم در 10X می‌شود. اگر منابع اجازه دهند، محققان پیشنهاد کردند که حداقل یک میلیون مطالعه توالی خوانی در هر نمونه برای به دست آوردن پوشش ژنومی بالای بیش از 80 درصد در عمق خواندن 10 برابر انجام شود. افزایش نسبت خواندن توالی به دو میلیون، ایجاد پوشش بالاتر را برای نمونه‌هایی که مقادیر Ct نسبتاً بالای بالای 31 داشتند، تسهیل کرد. با این حال، برای نمونه‌هایی با مقادیر Ct کمتر از 31، تنها تغییرات جزئی با میانگین 2.1٪ در پوشش در عمق خواندن 10 برابر بود. شناسایی شدند، به طور متوسط ​​2.1٪. برای بهینه‌سازی پوشش ژنوم، این تیم توصیه می‌کند نمونه‌های توالی‌بندی با مقدار Ct کمتر از 31 و حداقل یک میلیون خواندن در هر نمونه را انتخاب کنید، مخصوصاً در مورد منابع محدود.

از آنجایی که ژنوم های کلاد Omicron B.1 با سندرم حاد تنفسی اولیه ویروس 2 (SARS-CoV-2) پوشش محدودی داشتند، تیم از ژنوم قبل از شیوع کلاد A.1 به عنوان مرجعی برای طراحی پرایمر استفاده کرد. طرح پرایمر طراحی شده توسط PrimalScheme شامل 163 جفت پرایمر با طول آمپلیکون از 1597 تا 2440 جفت باز بود. در آزمایشگاه بهداشت عمومی ایالت ماساچوست (MASPHL)، تیم در مجموع 10 نمونه بالینی را با مقادیر مختلف Ct واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) با استفاده از روش های توالی یابی مبتنی بر آمپلیکون و همچنین متاژنومیک توالی یابی کردند.