تجزیه و تحلیل ساختاری ویروس آبله میمون برای هدایت توسعه عوامل ضد ویروسی گسترده


در مطالعه اخیر ارسال شده به bioRxiv* سرور پیش چاپ، محققان ساختار کریستالی ویروس آبله میمون (MPX) (MPXV) و مجموعه VP39، یک متیل ترانسفراز 2′-O-RNA (MTase) و سینفانگین، یک مهارکننده پان-MTase را بررسی کردند.

مطالعه: ساختار ویروس آبله میمون 2'-O-ریبوز متیل ترانسفراز VP39 در کمپلکس با سینفانگین پایه و اساس طراحی مهارکننده را فراهم می کند.  اعتبار تصویر: Marina Demidiuk/Shutterstock
مطالعه: ساختار ویروس آبله میمون 2′-O-ریبوز متیل ترانسفراز VP39 در کمپلکس با سینفانگین پایه و اساس طراحی مهارکننده را فراهم می کند. اعتبار تصویر: Marina Demidiuk/Shutterstock

تعداد موارد MPX ساعت به ساعت در سراسر جهان افزایش می یابد و می تواند نشان دهنده یک بیماری همه گیر جدید باشد. تجزیه و تحلیل ساختاری MPXV می تواند به توسعه عوامل ضد ویروسی موثر برای مبارزه با MPXV کمک کند. ویروس‌های پوکس آنزیم‌های نوع decapping را برای جلوگیری از تجمع اسید ریبونوکلئیک دو رشته‌ای (dsRNA) در طول عفونت رمزگذاری می‌کنند که می‌تواند پاسخ‌های ایمنی ضد ویروسی ذاتی را القا کند. MPXV آنزیم پوکسین را رمزگذاری می کند که مسیر cGAS-STING (سیکلیک GMP-AMP سینتاز – محرک ژن های اینترفرون) را مهار می کند.

متیلاسیون نوکلئوتید اولیه (NT) کلاهک بالغ MPXV (یا کلاه-1) در محل ریبوز 2′-O مستند شده است. MTase توسط خانواده ویروس‌های poxviridiae (از جمله MPXV) برای سنتز cap-0 مورد نیاز است و با افزودن یک گروه متیل دیگر در محل 2′-O ریبوز پروگزیمال، می‌توان کلاهک نابالغ (cap-0) را به بالغ تبدیل کرد. کلاه لبه دار. این مرحله برای جلوگیری از توسعه پاسخ های ایمنی ذاتی ضروری است و توسط VP39، 2′-O MTase MPXV کاتالیز می شود.

در مورد مطالعه

در مطالعه حاضر، محققان ساختار پیچیده VP39-sinefungin MPXV را برای بهبود درک مکانیسم های مهار مولکول VP39 توسط sinefungin ارزیابی کردند. آنها همچنین ساختار را با 2′-O MTases ویروس های RNA تک رشته ای (ssRNA) مانند ویروس زیکا و سندرم حاد تنفسی کروناویروس 2 (SARS-CoV-2) مقایسه کردند.

ژن VP39 سویه MPXV USA-May22 با کدون بهینه شد تا در E. coli برای سنتز و شبیه‌سازی بعدی بیان شود. سلول‌های E. coli BL21 با پلاسمید بیان‌کننده VP39 تبدیل شدند و IPTG (ایزوپروپیل-bD-تیوگالاکتوپیرانوسید) اضافه شد و به دنبال آن VP39 نوترکیب خالص شد. سلول ها سانتریفیوژ، لیز شدند و لیز مورد تجزیه و تحلیل کروماتوگرافی قرار گرفت. VP39 برای آزمایش‌های مبتنی بر کریستالیزاسیون، غلیظ و با سینفانگین مخلوط شد.

کریستال های تشکیل شده اولیه خرد شدند و صفحات بذر و بسترهای RNA با رونویسی تهیه شدند. درونکشتگاهی. پس از آن، سنجش 2′-O-MTase و تجزیه و تحلیل طیف سنجی جرمی اکو انجام شد. میزان فعالیت MTase، مهار 2′-O-MTase توسط سینوفانگین، و نرخ تبدیل سوبسترا (SAM) و نیمی از حداکثر غلظت مهاری (IC) تعیین شد.50) مقادیر تعیین شد.

مجموعه داده کریستالوگرافی بلورهای پراش به دست آمده مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. ویژگی‌های ساختاری مجتمع VP39/sinefungin با استفاده از روش جایگزینی مولکولی با ساختار پیچیده ویروس واکسن VP39/SAH به عنوان یک مدل جستجو مورد مطالعه قرار گرفت. برای تایید فعالیت آنزیمی VP39 نوترکیب، دو بستر با پایه های ماقبل آخر متفاوت (m7GpppA-RNA و m7GpppG-RNA) مورد آزمایش قرار گرفتند.

فعل و انفعالات VP39-sinefungin با ساخت یک مدل از sinefungin: RNA: VP39 کمپلکس برای نشان دادن مکانیسم‌های مولکولی نهفته در مهار VP39 توسط sinefungin تجزیه و تحلیل شد. علاوه بر این، سایت‌های کاتالیزوری VP39 با MTases 2′-O-ribose از ویروس‌های زیکا دور و SARS-CoV-2 مقایسه شدند.

نتایج

ساختار MPX شامل یک چین Rossman شبیه تاشوی آلفا/بتا (α/β)، با ورق β واقع در مرکز شامل β2-β10 در الگویی شبیه حرف J است. قابل ذکر است که این الگو برای پروتئین غیر ساختاری 2′-O MTase (nsp)1614 SARS-CoV-2 نیز یافت شد. ورقه β مرکزی از یک طرف توسط مارپیچ های آلفا-1، آلفا2، آلفا-6 و آلفا-7 و توسط مارپیچ های آلفا-3 و آلفا-7 در انتهای دیگر در جای خود محکم شده و دو طرف توسط β1 به هم متصل شده اند. β11 و α5.

هر دو بستر RNAS قابل قبول بودند. با این حال، یکی با پایه ماقبل آخر گوانین ترجیح داده شد. Sinefungin VP39 را با IC مهار کرد50 مقدار 41 میکرومولار مشخص شد که Sinefungin جیب SAM را با قسمت پایه آدنین خود در یک دره عمیق واقع شده که توسط زنجیره‌های جانبی آبگریز از باقی مانده‌های Val116، Phe115، Leu159 و Val139 با پیوند هیدروژنی واقع شده است، اشغال می‌کند. Sinefungin به طور موثر از منطقه 2′-O-ribose با گروه های آمینه خود در نزدیکی منطقه ریبوز 2 که در آن اتم گوگرد SAM در غیر این صورت قرار می گرفت محافظت کرد.

دره SAM دو انتهای داشت، که یک انتهای آن در مجاورت پاکت RNA برای قرار دادن SAM برای واکنش‌های متیل ترانسفراز حیاتی بود، و انتهای مخالف واقع در کنار پایه آدنین سینوفانگین خالی بود. در بررسی دقیق‌تر، محل یک شبکه مولکول آب پیچیده را نشان داد که با پیوند هیدروژنی متصل شده و به باقی مانده‌های Glu118، Asn156، و Val116 و بخش آدنین متصل است.

مولکول‌های مبتنی بر داربست Sinefungin که دارای بخش‌هایی هستند که می‌توانند مولکول‌های آب را جابه‌جا کنند و مستقیماً با باقی‌مانده‌های Glu118، Asn156 و Val116 تعامل داشته باشند، می‌توانند اتصال‌دهنده‌های فوق‌العاده‌ای باشند، زیرا جابجایی مولکول‌های آب می‌تواند اثرات آنتروپیک مطلوبی ایجاد کند. شباهت محل اتصال MPXV SAM با زیکا و SARS-CoV-2 قابل توجه بود. ترکیبات یکسانی در بین سینفانگین و پروتئین های NS5، nsp16 و VP39 زیکا، SARS-CoV-2 و MPXV مشاهده شد.

تتراد باقی مانده کاتالیزوری (Asp138، Lys41، Glu218، و Lys175) برای MPXV در بین سه ویروس دور آزمایش شده، از جمله ترکیبات باقی مانده، حفظ شد. علاوه بر این، همه ویروس‌ها از باقیمانده آسپارتات برای تعامل با گروه آمینه سینفانگین استفاده کردند. حالت های اتصال حفظ شده در بین سه ویروس نشان داد که یک مهارکننده MTase می تواند به طور بالقوه به عنوان یک عامل ضد ویروسی مورد استفاده قرار گیرد. با این حال، تفاوت در نوکلئوباز و ریبوز حلقه حالت اتصال مشاهده شد.

به طور کلی، یافته های مطالعه نشان داد که مهارکننده های مبتنی بر MTase می توانند اهداف پان ضد ویروسی باشند.

*تذکر مهم

bioRxiv گزارش‌های علمی مقدماتی را منتشر می‌کند که توسط همتایان مورد بررسی قرار نمی‌گیرند و بنابراین، نباید به‌عنوان نتیجه‌گیری، راهنمای عمل بالینی/رفتار مرتبط با سلامتی در نظر گرفته شوند یا به عنوان اطلاعات ثابت تلقی شوند.



منبع