با این حال، شکنش سلول نشان داد که در هر دو هسته و سیتوپلاسم قرار دارد. علاوه بر این، تیم دریافت که ORF8 با لامین های B1 و A/C در سلول های ترانسفکت شده کلوکالیزه شده است. الگوی بیان در رده سلولی A549 آلوده به SARS-CoV-2 که آنزیم مبدل آنژیوتانسین 2 (ACE2) را بیان می کند تأیید شد. سپس، اتصال کروماتین با استفاده از افزایش غلظت نمک ارزیابی شد. ORF8 از بخش کروماتین در غلظت‌های مشابه نمک مانند لامین‌ها و هیستون‌ها جدا شد.
ORF8 همچنین با لیزین استیل ترانسفراز 2A (KAT2A) مرتبط است. ORF8ΔARKSAP با پروتئین های کروماتین مرتبط نبود، نشان می دهد که موتیف ARKSAP ارتباط ORF8 با پروتئین های کروماتین را افزایش می دهد. تجزیه و تحلیل طیف سنجی جرمی هدفمند برای بررسی اینکه آیا سایت تقلید هیستون به طور مشابه به عنوان هیستون اصلاح شده است انجام شد. این یک بقایای لیزین را در محل تقلید پیشنهادی شناسایی کرد که مشابه هیستون H3 استیله شده بود.
این مطالعه نشان داد که SARS-CoV-2 ORF8 حاوی یک موتیف ARKS است و بیان ORF8 تنظیم PTM های هیستونی را مختل می کند. محققان ارتباط ORF8 را با پروتئین های مرتبط با کروماتین، لایه هسته ای و هیستون ها دریافتند. مشابه هیستون ها، ORF8 در درون موتیف تقلید هیستون دچار استیلاسیون می شود.
ژن‌ها در پاسخ به ORF8 نسبت به ORF8 تنزل کردندΔARKSAP دسترسی کروماتین بیشتر و سطوح پایه بالاتری از اصلاح H3K9ac نسبت به ژن‌های تنظیم‌شده بالا داشت. بعد، یک جهش یافته SARS-CoV-2 فاقد ORF8 (SARS-CoV-2ΔORF8) ایجاد شد؛ A549ACE2 سلول ها با این جهش یافته یا SARS-CoV-2 برای مقایسه سطوح ژنومی ویروس و تولید ذرات ویروسی آلوده شدند.
آزمایش‌های بیشتر با یک جهش یافته SARS-CoV-2 که در آن موتیف ARKSAP از ORF8 (SARS-CoV-2) حذف شدΔARKSAP) کاهش قابل توجهی از اثرات عفونت بر H3K9ac و دسترسی کروماتین را نشان داد و اثرات عفونت را تکرار کرد. ORF8 حذف عفونت با نوع وحشی SARS-CoV-2 بیان KAT2A را کاهش داد، در حالی که SARS-CoV-2ΔARKSAP یا SARS-CoV-2ΔORF8 عفونت نداشت.
شواهد اخیر نشان می دهد که عفونت با SARS-CoV-2 پاسخ های ایمنی ذاتی را سرکوب می کند و تنظیم اپی ژنتیک را مختل می کند. با این حال، ناشناخته باقی مانده است که چگونه این اتفاق می افتد. به ندرت، سایر ویروس‌های بدخیم ممکن است با تقلید از پروتئین‌های میزبان، به‌ویژه هیستون‌ها، در تنظیم اپی ژنتیکی اختلال ایجاد کنند. هیستون ها DNA را به ساختارهای پیچیده می بندند و دسترسی به ژنوم را تنظیم می کنند.
مطالعه حاضر بررسی کرد که آیا SARS-CoV-2 از تقلید هیستون برای اختلال در تنظیم کروماتین و پاسخ عفونت استفاده می کند یا خیر. ابتدا، محققان یک مقایسه بیوانفورماتیک پروتئین SARS-CoV-2 با هیستون های انسانی را انجام دادند. یک تطابق یکسان از شش باقیمانده بین اسیدهای آمینه 50 تا 55 قاب خواندن باز 8 وجود داشت (ORF8) و نواحی بحرانی در انتهای N هیستون H3.
علاوه بر این، بیان ORF8 باعث کاهش قابل توجه فراوانی KAT2A شد، در حالی که پروتئین های لایه هسته ای و سطوح هتروکروماتین مرتبط با لایه بدون تغییر باقی ماندند یا کمی افزایش یافتند. سپس، تیم مشاهده کردند که PTMهای هیستونی مرتبط با سرکوب رونویسی در سلول‌های HEK293T ترانسفکت‌شده که ORF8 را بیان می‌کنند، افزایش می‌یابد، در حالی که آنهایی که با بیان ژن فعال مرتبط هستند تخلیه می‌شوند. به طور خاص، آنهایی که در موتیف ARKS H3 بودند، بسیار مختل شدند.
در مطالعه اخیر منتشر شده در طبیعتمحققان نشان دادند که یک پروتئین سندرم حاد تنفسی ویروس کرونا 2 (SARS-CoV-2) به عنوان یک هیستون تقلید کننده عمل می کند تا تنظیم اپی ژنتیکی سلول های میزبان را مختل کند.
هیستون ها تحت طیفی از تغییرات پس از ترجمه (PTMs) قرار می گیرند که به صورت دینامیکی برای کنترل بیان ژن تنظیم می شوند. تقلید هیستون ویروس ها را قادر می سازد تا توانایی سلول ها برای پاسخ به عفونت و تنظیم بیان ژن را مختل کنند. با این وجود، تقلید هیستون توسط کروناویروس ها (CoVs) هنوز تایید نشده است.
مطالعه و یافته ها
سپس، محلی سازی درون سلولی ORF8 مورد بررسی قرار گرفت تا بررسی شود که آیا به عنوان یک تقلید هیستون عمل می کند یا خیر. سلول‌های HEK293T با ساختاری با برچسب استرپتوکوک که ORF8 را کد می‌کند، ترانسفکت شدند که با استفاده از یک پروب فلورسنت مشاهده شد. ایمونوفلورسانس نشان داد که ORF8 به طور معمول در سیتوپلاسم و محیط هسته موضعی است.
حذف ORF8 باعث کاهش تکثیر ویروسی در سلول های iAT2 شد، در حالی که تعداد کپی ژنوم ویروسی به صراحت تحت تأثیر از دست دادن موتیف تقلید هیستون قرار گرفت. به طور کلی، محققان مورد جدیدی از تقلید هیستون را در طول عفونت SARS-CoV-2 شناسایی کردند و مکانیسم هایی را توصیف کردند که توسط آن ویروس تنظیم کروماتین سلول های میزبان را مختل می کند.