دونالد اینگبر نیز است جودا فولکمن استاد زیست شناسی عروقی در دانشکده پزشکی هاروارد و بیمارستان کودکان بوستون، و Hansjörg Wyss استاد مهندسی با الهام از زیست در دانشکده مهندسی و علوم کاربردی هاروارد جان A. Paulson.
با در نظر گرفتن افراطی Light-Seq، ما توانستیم رونوشت کامل یک نوع سلول بسیار نادر، به نام “سلول های آماکرین دوپامینرژیک” (DACs) را جدا کنیم، که جداسازی آن به دلیل اتصالات پیچیده آن به سلول های دیگر بسیار سخت است. وست گفت: شبکیه، تنها با بازیابی چهار تا هشت سلول بارکد جداگانه در هر مقطع. DAC ها در تنظیم ریتم شبانه روزی چشم با تنظیم دقیق ادراک بصری در مواجهه با نورهای مختلف در طول چرخه روز و شب نقش دارند. “Light-Seq همچنین RNA هایی را که به طور خاص در DAC ها در سطوح پایین بیان می شدند، و همچنین ده ها RNA نشانگر زیستی اختصاصی DAC را انتخاب کرد که تا آنجا که ما قبلاً توصیف نشده بودند، فرصت های جدیدی را برای مطالعه این نوع سلول نادر باز می کند. وست افزود، که در زمان مطالعه دانشجوی کارشناسی ارشد و سپس در مقطع فوق دکتری با Cepko بود و اکنون در تلاش تجاری سازی Light-Seq به کیشی پیوسته است.
پروژه Light-Seq توسط Jocelyn (Josie) Kishi، Ph.D.، Sinem Saka، Ph.D.، و Ninning Liu، Ph.D. رهبری شد. در گروه یین در Wyss، و اما وست، Ph.D. در آزمایشگاه Constance Cepko در HMS. پیش از این، کیشی و ساکا SABER-FISH را به عنوان یک روش رونویسی فضایی برای تصویربرداری بیان ژن به طور مستقیم در بافت های دست نخورده توسعه داده بودند.در موقعیت). “با SABER-FISH، ما هنوز از گرفتن برنامه‌های بیان ژن کامل سلول‌ها با هزاران مولکول RNA مختلف در هر سلول فاصله داشتیم. کیشی، نویسنده همکار و همکار، گفت. «Light-Seq این مشکل را با ترکیب برچسب‌گذاری بارکد با وضوح بالا با توالی‌سازی کامل رونویسی از طریق NGS حل می‌کند و بهترین‌ها و مزایای کلیدی اضافی را به ما می‌دهد.» در زمان مطالعه، کیشی یکی از همکاران توسعه فناوری Wyss در تیم یین بود و اکنون به همراه برخی از نویسندگان همکارش مسیری را برای تجاری‌سازی Light-Seq دنبال می‌کند.
منبع:
“برای اینکه بتوانیم این گردش کار بارکد را با NGS ادغام کنیم، یک واکنش دوخت جدید را مهندسی کردیم که مبتنی بر فناوری نانو DNA است. این نوآوری به ما امکان می دهد cDNA های بارکد شده خود را به دنباله های خواندن پیوسته تبدیل کنیم. سپس می توانیم مجموعه کامل بارکد حاوی را استخراج کنیم. توالی های cDNA از نمونه، و تجزیه و تحلیل آنها با تکنیک های استاندارد NGS.” “در نهایت، هر بارکد بازخوانی کامل رونوشت را به سلول های از پیش انتخاب شده در نمونه بافت ردیابی می کند، که برای تجزیه و تحلیل های بعدی دست نخورده باقی می ماند. این فرصت منحصر به فردی را برای ما فراهم می کند تا دقیقاً همان سلول ها را پس از توالی یابی برای اعتبارسنجی یا اکتشاف بیشتر دوباره مشاهده کنیم.”
چشم به بافت های پیچیده و سلول های کمیاب
پس از اولین اعتبارسنجی Light-Seq در سلول‌های کشت‌شده، تیم یین می‌خواست آن را روی یک بافت پیچیده اعمال کند و با گروه Constance Cepko، Ph.D. همکاری کرد. در HMS Cepko یکی از نویسندگان متناظر این مطالعه و پروفسور Bullard ژنتیک و علوم اعصاب در موسسه Blavatnik در HMS است و توسعه شبکیه را به عنوان مدلی از سیستم عصبی بررسی می کند. کیشی، ساکا و لیو به نیروهای وست در گروه سپکو پیوستند تا Light-Seq را روی مقاطع شبکیه موش اعمال کنند و سه لایه اصلی با عملکردهای متفاوت را نمایان کنند. محققان به پوشش توالی قابل مقایسه با روش های توالی یابی تک سلولی دست یافتند و دریافتند که هزاران RNA بین سه لایه اصلی شبکیه غنی شده است. آنها همچنین نشان دادند که پس از استخراج توالی، نمونه‌های بافت دست نخورده باقی ماندند و می‌توان آنها را برای پروتئین‌ها و سایر مولکول‌های زیستی تصویربرداری کرد.
پیشرفت جدیدی که در مؤسسه مهندسی الهام گرفته از بیولوژیک Wyss در دانشگاه هاروارد انجام شد اکنون با روش مبتنی بر فناوری نانو DNA به نام “Light-Seq” بر این محدودیت ها غلبه کرده است. Light-Seq به محققان اجازه می دهد تا مجموعه کامل توالی های RNA را با بارکدهای DNA منحصر به فرد منحصر به چند سلول مورد علاقه “ژئوتگ” کنند. این سلول های هدف با استفاده از نور زیر میکروسکوپ انتخاب می شوند از طریق یک فرآیند فتو متقاطع سریع و موثر.
دونالد اینگبر، MD، Ph.D.، مدیر موسس Wyss
برای توالی‌یابی خاص سلول‌ها در مکان‌های انتخابی سفارشی نمونه‌های بافت دست نخورده، ما یک رویکرد جدید برای بارکدهای DNA متقاطع به کپی‌هایی از مولکول‌های RNA و یک روش مبتنی بر فناوری نانو DNA ایجاد کردیم که آنها و توالی‌های RNA متصل به آنها را قابل خواندن توسط NGS می‌کند. لیو، نویسنده اول، عضو فوق دکتری در گروه یین که قبلاً یک پلت فرم بارکد DNA موازی را برای یک روش تصویربرداری با وضوح فوق العاده به نام “Action-PAINT” توسعه داده است، گفت که یکی از اجزای اصلی Light-Seq نیز شد.
“ترکیب منحصر به فرد از ویژگی های Light-Seq یک نیاز برآورده نشده را برآورده می کند: توانایی انجام تجزیه و تحلیل توالی یابی عمیق، اگر نگوییم غیرممکن برای جداسازی جمعیت های سلولی سخت یا انواع سلول های نادر در بافت های حفظ شده، با اطلاعات تصویربرداری، از نظر مکانی تجویز شده است. پنگ یین، Ph.D.، یکی از چهار نویسنده متناظر و یکی از اعضای هیئت علمی در موسسه Wyss، گفت: مطابقت وضعیت بیان ژن بسیار تصفیه شده آنها با ویژگی های فضایی، مورفولوژیکی و بالقوه مرتبط با بیماری. گروه او Light-Seq را توسعه داد. بنابراین، این پتانسیل برای پیشبرد سریع فرآیند اکتشاف بیولوژیکی در حوزه‌های مختلف تحقیقات زیست‌پزشکی را دارد. یین همچنین استاد زیست شناسی سیستمی در دانشکده پزشکی هاروارد (HMS) است.
از بارکد در موقعیت به ترتیب بندی در محل
با این حال، این رویکردهای “رونویسی فضایی” هنوز تنها کسری از مولکول‌های RNA کل سلول را جذب می‌کنند و نمی‌توانند عمق و کیفیت تجزیه و تحلیل ارائه شده توسط روش‌های توالی‌یابی تک سلولی را که برای بررسی رونوشت‌های سلول‌های منفرد جدا شده از بافت‌ها ایجاد شده‌اند، ارائه دهند. یا سیالات زیستی از طریق تکنیک های توالی یابی نسل بعدی (NGS) آنها همچنین به محققان اجازه نمی‌دهند که فقط سلول‌های خاصی را بر اساس موقعیت آنها در بافت وارد کنند، که این امر می‌تواند تا حد زیادی به دنبال جمعیت‌های سلولی از هم گسیخته یا سلول‌های کمیاب و دشوار جداسازی مانند سلول‌های مغزی نادر با عملکردهای منحصربه‌فرد یا سیستم ایمنی کمک کند. سلول هایی که به تومورها حمله می کنند. علاوه بر این، از آنجایی که محیط بافت اصلی مختل شده است، بسیاری از روش‌های رونویسی فضایی و تمام روش‌های توالی‌یابی تک سلولی، محققان را از مراجعه مجدد به نمونه‌های خود برای انجام آنالیز پیگیری باز می‌دارد و به دلیل نیاز به ابزار یا معرف‌های تخصصی، هزینه بر هستند.
ابتدا، آغازگرهای DNA با مولکول‌های RNA در سلول‌ها جفت می‌شوند و برای ایجاد کپی‌هایی از توالی‌های RNA به نام توالی‌های DNA مکمل (cDNA) گسترش می‌یابند. سپس رشته‌های بارکد DNA حاوی یک نوکلئوتید فتو متقاطع‌کننده فوق‌سریع به نوبه خود با cDNA در سلول‌ها جفت می‌شوند. هنگامی که سلول هدف زیر میکروسکوپ از طریق یک دستگاه نوری استنسیل مانند روشن می‌شود که سلول‌های غیرهدف دیگر را در میدان میکروسکوپی در تاریکی نگه می‌دارد و در نتیجه آنها را از واکنش متقاطع نوری در امان نگه می‌دارد، این سلول‌ها برای همیشه به یکدیگر متصل می‌شوند. پس از شستن توالی های DNA بارکد شده از سلول هایی که به طور دائم به هم متصل نبودند در موقعیت، این روش را می توان با بارکدهای مختلف و الگوهای نور تکرار کرد تا مناطق مورد علاقه بیشتری را برچسب گذاری کند.
باز کردن زمینه رونویسی فضایی تا NGS همچنین اطلاعاتی را در مورد سطح یک گونه RNA اضافه می کند. “داده های توالی یابی ما به وضوح نشان داد که Light-Seq می تواند تغییرات طبیعی در ساختار RNA ها را تعیین کند. در آینده، ما علاقه زیادی به استفاده از Light-Seq برای درک بهتر تعامل بین سیستم ایمنی، سلول های منتشر کننده بیماری و انواع مختلف داریم. کیشی گفت: راهبردهای درمانی مانند ژن و سلول درمانی.
در زیر میکروسکوپ، محققان اغلب انواع سلول‌های مختلف را مشاهده می‌کنند که خود را در الگوهای عجیب و غریب در بافت‌ها سازماندهی می‌کنند، یا گاهی اوقات یک نوع سلول نادر را مشاهده می‌کنند که با اشغال یک موقعیت منحصربه‌فرد، نشان دادن یک شکل غیرعادی، یا بیان یک مولکول نشانگر زیستی خاص خودنمایی می‌کند. برای تعیین معنای عمیق‌تر مشاهدات خود، آنها با تجزیه و تحلیل مولکول‌های RNA مشتق‌شده از ژن موجود در آنها، رویکردهایی برای دسترسی به الگوهای بیان ژن سلول‌ها (ترانسکریپتوم‌ها) توسعه داده‌اند که می‌توانند با شکل‌ها، موقعیت‌های مکانی و مولکولی سلول‌ها مطابقت داشته باشند. نشانگرهای زیستی
فناوری Light-Seq که در گروه پنگ یین در ابتکار رباتیک مولکولی مؤسسه Wyss توسعه یافته است، دوباره نشان می‌دهد که چگونه دنبال کردن یک رویکرد کاملاً غیر متعارف و استفاده از زیست‌شناسی مصنوعی می‌تواند منجر به یک فناوری مخرب با پتانسیل زیادی برای پیشرفت تحقیقات بنیادی و پزشکی بالینی شود.
کیشی، جی، و همکاران (2022) Light-Seq: بارکدگذاری درجا با هدایت نور از مولکول های زیستی در سلول ها و بافت های ثابت برای توالی یابی نمایه شده فضایی. روش های طبیعت doi.org/10.1038/s41592-022-01604-1.
مرجع مجله:
موسسه Wyss برای مهندسی الهام گرفته از بیولوژیکی در هاروارد
با کمک یک نانوتکنولوژی جدید DNA، توالی‌های RNA بارکد شده به رشته‌های DNA منسجم ترجمه می‌شوند که سپس می‌توانند از نمونه بافت جمع‌آوری شده و با استفاده از NGS شناسایی شوند. فرآیند Light-Seq را می توان با بارکدهای مختلف برای جمعیت های سلولی مختلف در یک نمونه تکرار کرد، که برای تجزیه و تحلیل بعدی دست نخورده باقی می ماند. با عملکردی قابل مقایسه با روش های توالی یابی تک سلولی، به طور قابل توجهی عمق و دامنه تحقیقات ممکن بر روی یک نمونه بافت را گسترش می دهد. روش در منتشر شده است روش های طبیعت .