محققان MIT تکنیک جدیدی را برای مطالعات ژنومی کبد توسعه دادند


توانایی کبد برای بازسازی خود افسانه ای است. حتی اگر بیش از 70 درصد از اندام برداشته شود، بافت باقیمانده می تواند یک کبد جدید را دوباره رشد دهد.

محققان MIT تکنیک جدیدی را برای مطالعات ژنومی کبد توسعه دادند
محققان MIT روش جدیدی برای انجام مطالعات ژنومی کبد با استفاده از سیستم ویرایش ژن CRISPR ایجاد کرده اند. اعتبار تصویر: iStockphoto

کریستین ناوز، استادیار زیست شناسی MIT، می خواهد دریابد که چگونه کبد قادر به دستیابی به این نوع بازسازی است، به این امید که یاد بگیرد چگونه سایر اندام ها را وادار به انجام همین کار کند. برای این منظور، آزمایشگاه او با استفاده از سیستم ویرایش ژن CRISPR، روش جدیدی را برای انجام مطالعات ژنومی کبد در موش‌ها ایجاد کرده است.

با این روش جدید، محققان می توانند بررسی کنند که هر یک از ژن های موجود در ژنوم موش چگونه بر بیماری یا رفتار خاصی تأثیر می گذارد. در مقاله‌ای که این تکنیک را توصیف می‌کند، محققان چندین ژن مهم برای بقا و تکثیر سلول‌های کبدی را کشف کردند که قبلاً در مطالعات سلول‌های رشد یافته در یک ظرف آزمایشگاهی دیده نشده بود.

Knouse که همچنین یکی از اعضای کخ MIT است می‌گوید: «اگر ما واقعاً می‌خواهیم فیزیولوژی و بیماری پستانداران را درک کنیم، باید این فرآیندها را در ارگانیسم زنده تا جایی که ممکن است مطالعه کنیم، زیرا در اینجاست که می‌توانیم زیست‌شناسی را در بومی‌ترین بافت آن بررسی کنیم. موسسه تحقیقات یکپارچه سرطان.

Knouse نویسنده ارشد مقاله جدید است که امروز در ژنومیک سلولی. هدر کیز، مدیر پلتفرم ژنومیک عملکردی در موسسه Whitehead، یکی از نویسندگان این مطالعه است.

بافت خارج سلولی

به عنوان یک دانشجوی کارشناسی ارشد در MIT، Knouse از بافت کبد بازسازی شده به عنوان مدلی برای مطالعه جنبه ای از تقسیم سلولی به نام جداسازی کروموزوم استفاده کرد. در طول این مطالعه، او مشاهده کرد که سلول های تقسیم شده در کبد مانند سلول های کبدی که در یک ظرف آزمایشگاهی تقسیم می شوند، رفتار نمی کنند.

او می‌گوید: «آنچه من از آن تحقیق درونی کردم این بود که تا چه حد چیزی به عنوان ذاتی سلول مانند تقسیم سلولی، چیزی که ما مدت‌ها تصور می‌کردیم مستقل از هر چیزی فراتر از سلول است، به وضوح تحت تأثیر محیط خارج سلولی است.» وقتی سلول‌ها را در محیط کشت مطالعه می‌کنیم، تأثیر آن بافت خارج سلولی را از دست می‌دهیم.»

با این حال، بسیاری از انواع مطالعات، از جمله صفحه نمایش های گسترده ژنومی که از فناوری هایی مانند CRISPR استفاده می کنند، در مقیاس کل ارگانیسم دشوارتر است. سیستم ویرایش ژن CRISPR از آنزیمی به نام Cas9 تشکیل شده است که DNA را در یک مکان معین قطع می کند و توسط رشته ای از RNA به نام RNA راهنما هدایت می شود. این به محققان اجازه می دهد تا یک ژن در هر سلول را در جمعیت عظیمی از سلول ها از بین ببرند.

در حالی که این رویکرد می‌تواند ژن‌ها و پروتئین‌های دخیل در فرآیندهای سلولی خاص را آشکار کند، ثابت شده است که تحویل اجزای CRISPR به طور مؤثر به سلول‌های کافی در بدن برای مفید کردن آن برای مطالعات حیوانی دشوار است. در برخی از مطالعات، محققان از CRISPR برای حذف حدود 100 ژن مورد علاقه استفاده کرده‌اند، که اگر بدانند چه ژن‌هایی را می‌خواهند مطالعه کنند، مفید است، اما این رویکرد محدود، ژن‌های جدید مرتبط با عملکرد یا بیماری خاصی را آشکار نمی‌کند.

چند گروه تحقیقاتی از CRISPR برای انجام نمایشگرهای گسترده ژنومی در مغز و سلول‌های پوست استفاده کرده‌اند، اما این مطالعات به تعداد زیادی موش برای کشف ضربه‌های مهم نیاز داشت.

برای ما، و من فکر می‌کنم بسیاری از محققین دیگر، قابلیت کشش آزمایشی محدود مدل‌های موش مدت‌هاست که مانع از توانایی ما در بررسی مسائل فیزیولوژی و بیماری پستانداران به شیوه‌ای بی‌طرفانه و جامع شده است. این چیزی است که من واقعاً می‌خواستم تغییر دهم، تا قابلیت انتقال آزمایشی را که زمانی به کشت سلولی محدود می‌شد، به ارگانیسم بیاورم، به طوری که دیگر در توانایی خود برای کشف اصول بنیادی فیزیولوژی و بیماری در بافت اصلی آنها محدود نباشیم.»

کریستین ناز، استادیار زیست شناسی، MIT

Knouse برای هدایت رشته‌های RNA به داخل سلول‌های کبدی، نوع سلولی غالب در کبد، تصمیم گرفت از لنتی ویروس استفاده کند، یک ویروس غیر بیماری‌زای مهندسی شده که معمولاً برای وارد کردن مواد ژنتیکی به ژنوم سلول‌ها استفاده می‌شود. او RNA های راهنما را به موش های تازه متولد شده تزریق کرد، به طوری که وقتی RNA راهنما در ژنوم ادغام شد، با رشد موش ها به نسل های بعدی سلول های کبدی منتقل می شود. پس از ماه‌ها تلاش در آزمایشگاه، او توانست RNA‌های راهنما را دریافت کند که به طور مداوم در ده‌ها میلیون سلول کبدی بیان می‌شوند، که برای انجام یک غربالگری گسترده ژنوم تنها در یک حیوان کافی است.

تناسب اندام سلولی

برای آزمایش این سیستم، محققان تصمیم گرفتند به دنبال ژن‌هایی بگردند که بر تناسب سلول‌های کبدی تأثیر می‌گذارند – توانایی سلول‌های کبدی برای بقا و تکثیر. برای انجام این کار، آنها کتابخانه ای از بیش از 70000 RNA راهنما را تحویل دادند که بیش از 13000 ژن را هدف قرار می داد و سپس تأثیر هر ناک اوت را بر تناسب سلولی تعیین کردند.

موش‌های مورد استفاده برای این مطالعه به گونه‌ای مهندسی شدند که Cas9 را می‌توان در هر مقطعی از عمرشان روشن کرد. محققان با استفاده از گروهی متشکل از چهار موش – دو نر و دو ماده – بیان Cas9 را زمانی که موش‌ها پنج روزه بودند، فعال کردند. سه هفته بعد، محققان سلول های کبدی آنها را غربالگری کردند و میزان وجود هر RNA راهنما را اندازه گرفتند. اگر یک RNA راهنمای خاص فراوان باشد، به این معنی است که ژن مورد نظر می تواند بدون آسیب کشنده به سلول ها حذف شود. اگر یک RNA راهنما در صفحه نمایش نشان داده نشود، به این معنی است که حذف آن ژن برای سلول ها کشنده بوده است.

این صفحه نمایش صدها ژن مرتبط با تناسب سلول های کبدی را نشان داد و نتایج در بین چهار موش بسیار سازگار بود. محققان همچنین ژن های شناسایی شده را با ژن هایی مقایسه کردند که با بیماری کبد انسان مرتبط است. آنها دریافتند که ژن های جهش یافته در سندرم های نارسایی کبدی نوزادان نیز باعث مرگ سلول های کبدی در صفحه نمایش آنها می شود.

این صفحه نمایش همچنین ژن های تناسب اندام حیاتی را نشان داد که در مطالعات سلول های کبدی رشد کرده در یک ظرف آزمایشگاهی شناسایی نشده بودند. بسیاری از این ژن‌ها در تعامل با سلول‌های ایمنی یا مولکول‌های موجود در ماتریکس خارج سلولی که سلول‌ها را احاطه کرده است، درگیر هستند. Knouse می‌گوید: این مسیرها احتمالاً در غربال‌های انجام‌شده در سلول‌های کشت‌شده ظاهر نمی‌شوند، زیرا این مسیرها شامل تعاملات سلولی با محیط خارجی آن‌ها است.

با مقایسه نتایج حاصل از موش‌های نر و ماده، محققان چندین ژن را شناسایی کردند که دارای اثرات خاص جنسی بر تناسب اندام بودند که به تنهایی با مطالعه سلول‌ها امکان پذیر نبود.

تجدید و بازسازی کنید

Knouse اکنون قصد دارد از این سیستم برای شناسایی ژن هایی که برای بازسازی کبد حیاتی هستند استفاده کند.

بسیاری از بافت ها مانند قلب قادر به بازسازی نیستند زیرا فاقد سلول های بنیادی هستند و سلول های تمایز یافته قادر به تقسیم نیستند. با این حال، کبد نیز یک بافت بسیار تمایز یافته است که فاقد سلول های بنیادی است، با این حال این ظرفیت شگفت انگیز را برای بازسازی خود پس از آسیب حفظ می کند. نکته مهم این است که ژنوم سلول های کبد با ژنوم سلول های قلب تفاوتی ندارد. همه این سلول ها دارای دستورالعمل یکسانی در هسته خود هستند، اما سلول های کبدی به وضوح جملات مختلفی را در این راهنما می خوانند تا بازسازی شوند. چیزی که ما نمی دانیم این است که آن جملات چیست؟ آن ژن ها چیست؟ اگر بتوانیم آن ژن‌ها را شناسایی کنیم، شاید روزی بتوانیم به قلب دستور دهیم که بازسازی شود.»

این تکنیک غربالگری جدید همچنین می تواند برای مطالعه شرایطی مانند بیماری کبد چرب و سیروز استفاده شود. آزمایشگاه Knouse همچنین در حال کار بر روی گسترش این رویکرد به اندام‌هایی غیر از کبد است.

او می‌گوید: «ما باید راه‌هایی برای هدایت RNA‌ها به بافت‌های دیگر با کارایی بالا پیدا کنیم. با غلبه بر آن مانع فنی، می‌توانیم همان انعطاف‌پذیری تجربی را که اکنون در کبد در قلب یا سایر مسائل داریم، ایجاد کنیم.»

این تحقیق توسط جایزه استقلال زودهنگام مدیر مؤسسه ملی بهداشت NIH، کمک هزینه حمایتی (هسته) مؤسسه کوخ از مؤسسه ملی سرطان، و صندوق اسکات کوک و سیگن اوستبی تأمین شد.

منبع:

موسسه تکنولوژی ماساچوست

مرجع مجله:

کلیدها، منابع انسانی، و همکاران (2022) غربالگری CRISPR در مقیاس ژنوم در کبد تک موش. ژنومیک سلولی. doi.org/10.1016/j.xgen.2022.100217.



منبع