مدل سه بعدی in vitro برای بازتولید اختلال عملکرد اندوتلیال ناشی از COVID-19


در مطالعه اخیر ارسال شده به bioRxiv* سرور پیش چاپ، محققان یک سه بعدی (3D) توسعه دادند درونکشتگاهی مدل بافتی برای ارزیابی اثرات سندرم حاد تنفسی ویروس کرونا 2 (SARS-CoV-2) بر روی سلول های اندوتلیال عروقی.

مطالعه: پروتئین اسپایک SARS-CoV-2 باعث ایجاد اختلال در عملکرد اندوتلیال در شبکه های عروقی مهندسی شده سه بعدی می شود.  اعتبار تصویر: PHOTOCRIO Michal Bednarek/Shutterstock
مطالعه: پروتئین اسپایک SARS-CoV-2 باعث ایجاد اختلال در عملکرد اندوتلیال در شبکه های عروقی مهندسی شده سه بعدی می شود. اعتبار تصویر: PHOTOCRIO Michal Bednarek/Shutterstock

درونکشتگاهی مدل ها برای بهبود درک بیماری زایی بیماری کروناویروس 2019 (COVID-19) مورد نیاز است. قبلا، درونکشتگاهی، مدل‌های بافتی دوبعدی (2 بعدی) برای مطالعه اثرات عفونت SARS-CoV-2 بر اندوتلیوم با کاهش بیان مولکول چسبندگی سلولی، اختلال در سد اندوتلیال و افزایش ترشح سیتوکین‌های التهابی در سلول‌های اندوتلیال ایجاد شده‌اند. اما به دلیل عدم توانایی در شبیه سازی شبکه های عروقی، مدل های دو بعدی نمی توانند مدل سازی کنند in vivo شرایط دقیقاً مانند مدل های سه بعدی.

نویسندگان مطالعه حاضر قبلاً از سلول های بنیادی پرتوان القا شده توسط انسان (hiPSCs) که به پیش سازهای اندوتلیال (EPs) تمایز داده شده و در ساختارهای هیدروژل کلاژن کپسوله شده بودند برای ارزیابی رگ زایی استفاده کردند.

در مورد مطالعه

در مطالعه حاضر، محققان تجزیه و تحلیل قبلی خود را با ایجاد یک مدل سه بعدی برای مطالعه اختلال شبکه عروقی در COVID-19 گسترش دادند.

برای تجزیه و تحلیل، hiPSC های مشتق شده از فیبروبلاست های پوست ختنه گاه پوست انسان (DF19-19-9-11T) کشت و به hiPSC-EPs تمایز داده شدند. متعاقباً، خوشه تمایز (CD)34+ hiPSCEP ها با تجزیه و تحلیل FACS (مرتب سازی سلولی فعال شده با فلورسانس) و CD34 جدا شدند.+ hiPSCسلول های EP در یک ساختار هیدروژل کلاژن کپسوله شدند.

هیدروژل های کپسوله شده به مدت یک هفته برای تشکیل شبکه های مویرگی کشت داده شدند. پس از پنج روز کپسوله سازی، CD34+هیدروژل‌های کلاژن مملو از hiPSC-EP برای شبیه‌سازی عفونت‌های SARS-CoV-2 با پروتئین SARS-CoV-2 (S) (CSP) تحت درمان قرار گرفتند. سنجش انتشار سیتوکین برای اندازه گیری بیان سیتوکین التهابی پس از درمان CSP انجام شد. شبکه های کشتی مانند در CD34 تولید می شوند+ iPSCهیدروژل‌های کلاژن مملو از EP توسط ایمونوسیتوشیمی مشاهده شدند.

سلول ها همچنین با دگزامتازون تیمار و با میکروسکوپ کانفوکال مشاهده شدند. طول رگ، اتصال عروقی، و قطر لومن رگ بر اساس خط لوله محاسباتی قبلا توسعه‌یافته مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. اسید ریبونوکلئیک پیام رسان SARS-CoV-2 (mRNA) از هیدروژل ها تحت آنالیز qRT-PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز رونویسی معکوس کمی) قرار گرفت تا بیان mRNA را بر اساس مقادیر آستانه چرخه (Ct) تعیین کند.

علاوه بر این، تیم بررسی کرد که آیا CD34+HiPSCهایی که شبکه های عروقی را در هیدروژل های کلاژن تشکیل می دهند، آنزیم مبدل آنژیوتانسین 2 (ACE2) را بیان می کنند. علاوه بر این، بیان چندین ژن اندوتلیال مانند KDR (گیرنده دامنه درج کیناز)، CD31، CDH5 (کادهرین 5)، و CD34 برای ردیابی بلوغ اندوتلیال در طول دوره کشت یک هفته‌ای و ارتباط سطوح با بیان ACE2 مورد ارزیابی قرار گرفت.

نتایج

درمان با CSP به طور قابل‌توجهی نسبت سلول‌های سازنده عروق و اتصال شبکه عروقی را در EP‌های مشتق شده از hiPSCs محصور شده در هیدروژل‌های کلاژن کاهش داد. افزایش بیان سیتوکین های التهابی مطابق با یافته های بالینی مشاهده شد و درمان 17 نانوگرم در میلی لیتر دگزامتازون باعث کاهش اختلال عملکرد عروقی در سلول های تحت درمان با CSP شد. حتی در غیاب سلول‌های ایمونولوژیک، تیم می‌تواند از سه بعدی استفاده کند درونکشتگاهی مدل رگزایی برای شبیه سازی اختلال عملکرد ناشی از عفونت SARS-CoV-2 سلول های اندوتلیال نماینده تظاهرات بالینی COVID-19.

پس از درمان CSP، شبکه عروقی تراکم کاهش یافته و سلول های بیشتری با مورفولوژی گرد تغییر یافته نشان داد. تیمار CSP (10 میکروگرم بر میلی لیتر) به ترتیب به 22، 33 و 29 درصد کاهش در نقاط انتهایی عروق، نقاط انشعاب عروق و پیوندهای عروق منجر شد. کاهش متناظر مشاهده شده در استفاده از CSP در غلظت 100 میکروگرم بر میلی لیتر به ترتیب 17%، 24% و 22% بود.

از دست دادن اتصال شبکه عروقی در میان هیدروژل های کلاژن تیمار شده با CSP با کاهش 77 درصدی نسبت سلول هایی که بخشی از بزرگترین شبکه عروقی بودند مشاهده شد. هنگامی که CSP در روز اول اضافه شد، به ترتیب 19% و 31% کاهش در نقاط انشعاب عروق و کسر حجمی هیدروژل های کلاژن شامل سلول هایی که عروق را تشکیل می دهند مشاهده شد. کاهش متناظر مشاهده شده با اضافه شدن CSP در روز پنجم به ترتیب 59% و 66% بود که نشان دهنده سمیت بالاتر CSP زمانی که در روز پنجم پس از شروع تشکیل شبکه های عروقی اضافه شد، بود.

بیان ACE2 در روز صفر بالاترین میزان بود و طی یک هفته پس از درمان CSP 62 درصد کاهش یافت. این تیم کاهش بیان CD34 را به ترتیب 2.7 و 6.7 برابر در روز اول و پنجم مشاهده کردند. در مقابل، بیان CD31 در روزهای 1، 5 و 7 به ترتیب دو برابر، چهار برابر و هفت برابر و بیان CDH5 در روز پنجم و هفتم به ترتیب دو برابر و سه برابر افزایش یافت.

درمان CSP به طور قابل توجهی آزادسازی اینترلوکین 8 (IL-8) و لیگاند 1 موتیف کموکاین CXC (CXCL1) را به ترتیب دو برابر و سه برابر افزایش داد. هر دو سیتوکین توسط سلول های اندوتلیال تولید می شوند و در COVID-19 تنظیم می شوند. یافته‌ها نشان داد که درمان CSP یک حالت التهابی قابل مقایسه با طوفان سیتوکین ثبت شده در موارد شدید COVID-19 ایجاد می‌کند.

به طور کلی، یافته های مطالعه نشان داد که تولید مثل موفقیت آمیز اختلال عملکرد اندوتلیال ناشی از COVID-19 مشاهده شده در محیط های بالینی با استفاده از هیدروژل های کلاژن مملو از hiPSC-EP تحت درمان با CSP. درمان CSP باعث اختلال عروقی قابل توجهی در مورد سلول های شبکه عروقی و اتصال شبکه عروقی شد که توسط دگزامتازون مهار شد.

*تذکر مهم

medRxiv گزارش‌های علمی مقدماتی را منتشر می‌کند که توسط همتایان بررسی نمی‌شوند و بنابراین، نباید به‌عنوان نتیجه‌گیری، راهنمای عمل بالینی/رفتار مرتبط با سلامتی در نظر گرفته شوند یا به عنوان اطلاعات ثابت تلقی شوند.



منبع