CDRH3 به طور گسترده فعال از یک کتابخانه تنوع توالی متوسط جدا شد، که بر پتانسیل عظیم سیستم گاو به عنوان منبعی برای به دست آوردن Abs به طور گسترده فعال است که می تواند در برابر ارگانیسم های بیماری زا جدید و انواع جهش یافته آنها محافظت کند. B9-scFv شامل 53 درصد از scFvهای به‌دست‌آمده از سلول‌های 293T با LV-transduced شده پس از انتخاب اتصال پروتئین S منفرد است که با غنی‌سازی بیشتر FC به 83 درصد افزایش می‌یابد. یافته‌ها نشان داد که B9-scFv تا حد زیادی عامل فعالیت ضد S در کتابخانه است.
یک اپی‌توپ CDRH3 scFv (B9-scFv) به‌طور گسترده واکنش‌پذیر و فوق‌العاده از یک کتابخانه زنجیره‌سنگین ساده از SARS-CoV-2 جدا شد که اتصال به SARS-CoV-2 RBD، همه گونه‌های نگران کننده SARS-CoV-2 را نشان داد. VOCs) و SARS-CoV RBD. اپی توپ ویروس‌های شبه‌تایپ S SARS-CoV را خنثی کرد، اما نه با رقابت با اتصال گیرنده ACE2 (آنزیم مبدل آنژیوتانسین 2).
در عوض، اپی توپ، LVهای شبه تایپ SARS-CoV را خنثی کرد، که به طور موقت از طریق حرکات پروتئین S بین دامنه ای در دسترس بودند و مجموعه prefusion را بی ثبات می کردند. اپی توپ در یک شکاف مرموز در سطح داخلی RBD، محلی که با ردپای چند شکم گسترده ضد SARS-CoV-2 مانند S2H97، 7D6/6D6 و FD20 همپوشانی دارد، قرار گرفته است.
سپس، تیم آمپلیکون ها را در نوار کاست pBovShow قرار داد. این کتابخانه پروتئینی قطعه متغیر تک زنجیره ای فوق طولانی (scFv) را برای شناسایی اتصال SARS-CoV-2 S با ترانسفکت کردن موقت کتابخانه scFv در سلول های 293T و انجام آنالیز FC غربالگری کرد. برای افزایش کارایی جداسازی scFv(s) با اتصال S، کتابخانه در وکتورهای LV (لنتی ویروس) کلون شد و ذرات شبه LV ویروس استوماتیت وزیکولی (VSV) تولید و در سلول‌های 293T تبدیل شدند تا توالی‌های scFv ترکیبی برای هر سلول به دست آید.
میل پیوندی به RBD های نوع SARS-CoV-2 در مقایسه با نوع وحشی (wt) S قابل مقایسه بود، و مشاهده اتصال B9-scFv به یک اپی توپ بسیار هدفمند و حفاظت شده را تقویت کرد. CR3022-scFv و B9-scFv انسانی مورد هدف SARS نسبتاً با سندرم تنفسی خاورمیانه CoV (MERS-CoV) RBD واکنش نشان ندادند، که نشان می‌دهد B9-scFv مختص SARS-CoV است.
به طور کلی، یافته های مطالعه پتانسیل را برجسته کرد درونکشتگاهیشکم گاوی بیان شده با CDRH3های فوق‌العاده طولانی برای جداسازی عوامل درمانی جدید و فعال برای مبارزه با ارگانیسم‌های بیماری‌زای نوظهور و انواع آنها و شناسایی اپی توپ‌های اصلی برای ساخت واکسن‌ها. این تیم بر یافته‌های گزارش‌شده قبلی مبنی بر جفت شدن مناطق CDRH3 فوق‌العاده با زنجیره‌های سبک Vλ نسبتاً ثابت برای ایجاد یک الگوی scFv که کتابخانه‌های زنجیره سنگین فوق‌العاده طولانی را می‌توان شبیه‌سازی و بیان کرد، حمایت کرد.
مطالعات گزارش کرده‌اند که آنتی‌بادی‌های خنثی‌کننده گسترده (Abs) به دلیل توانایی آنها در شناسایی اپی توپ‌های بسیار حفاظت‌شده که به ندرت در گونه‌های ویروسی جهش پیدا می‌کنند، پتانسیل زیادی به عنوان عوامل درمانی ضد ویروسی دارند. یک زیر مجموعه Ab گاو دارای یک منطقه تعیین کننده مکملی (CDR)H3 فوق العاده طولانی است که در شناسایی اپی توپ های ویروسی حفاظت شده بسیار ماهر است. با این حال، فعالیت آنها در برابر پروتئین های ساربکویروس (S) به خوبی مشخص نشده است و مستلزم بررسی بیشتر است.
در مورد مطالعه
یک صفحه نمایش سطح سلولی پستانداران برای غربالگری کتابخانه های CDRH3 Ab فوق العاده طولانی استفاده شد. لکوسیت gDNA (اسید دی اکسی ریبونوکلئیک ژنومیک) اگزون های متغیر گاوها برای تولید یک کتابخانه پاراتوپ گاوی فوق العاده طولانی تقویت شد. پس از آن، غنی‌سازی نواحی CDRH3 فوق‌العاده با واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) و انتخاب اندازه‌ها، برای تولید کتابخانه‌ای با CDRH3s فوق‌طول انجام شد.
نکته قابل توجه، B9-scFv هیچ واکنشی با سلول های غیر ترانسفکت نشده نشان نداد، حتی در غلظت های 5 میلی مولار به مدت یک ساعت، که به شدت نشان دهنده تعامل خاص S-Ab است. اتصال B9-scFv-S در سراسر جهش‌هایی مانند N501Y، D614G، Y453F، E484K، K417N، و L452R در VOCهای SARS-CoV-2 مانند بتا، آلفا، دلتا، گاما، Omicron و گاما حفظ شد. یافته ها نشان داد واکنش متقابل B9-scFv گسترده است.
در مطالعه اخیر منتشر شده در مجله شیمی بیولوژیکی، محققین یک درونکشتگاهی تجزیه و تحلیل برای جداسازی زنجیره‌های سنگین گاو بسیار طولانی که اتصال به سندرم حاد تنفسی شدید کروناویروس 2 (SARS-CoV-2) و کروناویروس‌های مرتبط (CoVs) را نشان دادند.
مطالعه: یک آنتی بادی گاوی که دارای یک ناحیه تعیین کننده مکملیت فوق العاده طولانی CDRH3 است، یک اپی توپ بسیار حفاظت شده در پروتئین های سنبله ساربکویروس را هدف قرار می دهد. اعتبار تصویر: آندری یاروفسکی/شاتراستوک
زمینه
فقط یک تفاوت جزئی برای اتصال B9-scFv به 200 نانومولار و 2.0 میکرومولار SARS-CoV RBD مشاهده شد که نشان دهنده میل اتصال نانومولاری است. B9-scFv تقریباً (98٪) ذرات شبه LV با SARS-CoV S (سویه Urbani) را در غلظت 70 میکروگرم در میلی لیتر خنثی کرد، اما چنین اثراتی را برای تیترهای SARS-CoV-2 معادل نشان نداد. نیمه حداکثر غلظت مهاری (IC50) مقدار خنثی سازی LV شبه تایپ SARS-CoV توسط B9-scFv 468 نانومتر بود.
در مطالعه اصلی اثبات اثبات حاضر، محققان با هدف جداسازی زنجیره‌های سنگین گاوی بسیار بلندی که می‌توانند به پروتئین‌های Sarbecovirus S متصل شوند، بودند. درونکشتگاهی.
سلول هایی که به طور موقت B9-scFv را بیان کردند، اتصال به S، RBD و S1 را نشان دادند، اما نه با S2، که نشان می دهد محل اتصال B9-scFv به باقی مانده اسید آمینه RBD 319 به باقی مانده 591 محلی شده است. اتصال B9-scFv به پروتئین S سلول های ترانسفکت شده وابسته به غلظت و غنی شده در مقایسه با کنترل scFv فوق العاده طولانی بود.
در مجموع 15 SCC (کلون های تک سلولی) برهمکنش S را نشان دادند که سه مورد آن حاوی سه scFv با یک توالی نوکلئوتیدی یکسان بود که به عنوان B9-scFv نامیده می شد. برای تعیین محل اپی توپ B9-scFv، زیرواحدهای SARS-CoV-2 S، دامنه اتصال گیرنده S1، S2 و S1 (RBD) با استفاده از آنالیز IMAC (کروماتوگرافی میل ترکیبی فلز بی حرکت) خالص شدند. طیف سنجی جرمی تبادل هیدروژن-دوتریوم افتراقی (MS) برای ارزیابی مکانیسم اتصال آنتی بادی انجام شد.
