در مطالعه اخیر ارسال شده به bioRxiv*، محققان استراتژی جدیدی را برای تشخیص سندرم حاد تنفسی ویروس کرونا 2 (SARS-CoV-2) با استفاده از نانوبادی‌های تثبیت‌شده با کیتین نشان دادند.
زمینه
کوسه و Camelidaeنانوبادی های مشتق شده جایگزین های نوظهوری برای آنتی بادی های سنتی هستند. نانوبادی‌ها در محدوده نانومولاری به لیگاندها متصل می‌شوند و در شرایط تنش ناشی از گرما/شیمیایی پایدار می‌مانند و آنها را کاندیدهای امیدوارکننده‌ای برای آزمایش گسترده آنتی‌ژن می‌کند. تعداد زیادی نانو بادی ضد SARS-CoV-2 از طریق نمایش فاژ یا با ایمن سازی لاماها، کوسه ها و آلپاکاها مهندسی شده اند.
شکل میکروبی از Ustilago میدیس (قارچ لکه ذرت) می تواند برای سنتز پروتئین های هترولوگ مانند نانو بادی ها مورد استفاده قرار گیرد. اخیرا، نویسندگان یک اصل اثبات برای سنتز نانوبادی‌های ضد SARS-CoV-2 ایجاد کرده‌اند. علاوه بر این، مکانیسم ترشح غیر متعارف استفاده شده توسط U. maydis برای صادرات کیتیناز Cts1 را می توان برای ترشح پروتئین های هدف هترولوگ استفاده کرد. Cts1 دارای فعالیت اتصال به کیتین است و بنابراین می تواند به عنوان یک برچسب تثبیت و خالص سازی ذاتی مورد استفاده قرار گیرد. Jps1، فاکتور لنگر مورد نیاز برای ترشح Cts1، می تواند یک حامل جایگزین باشد.
مطالعه و یافته ها
در مطالعه حاضر، محققان رویکرد جدیدی را برای شناسایی SARS-CoV-2 با استفاده از نانوبادی‌های تثبیت‌شده با کیتین ایجاد کردند. ابتدا، آنها پروتئین‌های همجوشی نانوبادی-Cts1 مختلف را برای بیان، ترشح غیرمتعارف و فعالیت اتصال در برابر دامنه اتصال گیرنده (RBD) سنبله SARS-CoV-2 غربالگری کردند. چهار ساختار همجوشی nanobody-Cts1 با استفاده از دو نانوبادی مشتق شده از لاما (VHH) سنتز شدند.E و VHHV) و دو نانو بادی مصنوعی (Sy15 و Sy68).
علاوه بر این، یک نانو جسم دو ظرفیتی با جفت شدن VHH تولید شدV با VHHE برای تولید VHHVE نانوکسی علاوه بر این، VHH دو ظرفیتیEE نانو جسم برای آزمایش توانایی اتصال دیمرها تولید شد. نسخه نانوکس منتشر شده Sy68/15-Jps1 و Sy68/15-Cts1 کنترل بودند. بیان / ترشح پروتئین های فیوژن هدف از طریق وسترن بلات مورد بررسی قرار گرفت.
رویی کشت ترشح کافی Sy را نشان داد15-Cts1، VHHV-Cts1، VHHE-Cts1، Sy68/15-Jps1 و VHHEEپروتئین های همجوشی Cts1. فعالیت اتصال RBD با استفاده از روش ایمونوسوربنت متصل به آنزیم مستقیم (ELISA) عصاره های سلولی حاوی پروتئین های همجوشی nanobody-Cts1 ارزیابی شد. VHHEE-Cts1 و Sy68/15-Jps1 قوی ترین اتصال را به RBD نشان داد، در حالی که VHHE-Cts1 حدود نیمی از شدت سیگنال را نشان داد. پروتئین های همجوشی باقی مانده فاقد فعالیت اتصال واضح بودند.
علاوه بر این، این سه پروتئین فیوژن در یک ELISA مستقیم در برابر پروتئین تمام قد SARS-CoV-2 S1 خالص و ارزیابی شدند. هر سه پروتئین فیوژن فعالیت اتصال قابل توجهی را نشان دادند. VHHEE-Cts1 و Sy68/15-Jps1 دو برابر افزایش اتصال نسبت به VHH داشتE-Cts1. محققان برای تعیین اینکه آیا سنجش های خنثی سازی تنظیم شده را انجام دادند درونکشتگاهی فعالیت ترجمه شده به in vivo الزام آور یا خنثی سازی
VHHE-Cts1 فاقد فعالیت خنثی کننده بود، در حالی که VHHEE-Cts1 و Sy68/15-Jps1 فعالیت خنثی کننده ویروس را نشان داد. از آنجایی که Cts1 می تواند به سطوح پوشش داده شده با کیتین مانند دانه های مغناطیسی کیتین متصل شود، این ویژگی می تواند برای توسعه یک استراتژی جدید آزمایش آنتی ژن مورد استفاده قرار گیرد. اتصال کیتین بر روی دانه‌های کیتین با استفاده از Cts1 نوترکیب خالص شده خلاصه شد. دانه های کیتین با Cts1 نوترکیب مخلوط شدند که اتصال پروتئین نوترکیب به کیتین را تایید کرد.
پروتئین فیوژن β-گلوکورونیداز (Gus)-Cts1 برای تعیین کمیت نتایج استفاده شد. پروتئین همجوشی Gus-Jps1 که پیش بینی می شد به کیتین متصل نشود، به عنوان کنترل منفی عمل کرد. دانه های کیتین با پروتئین های همجوشی Gus-Cts1 یا Gus-Jps1 پوشانده شدند. فقط پروتئین همجوشی Gus-Cts1 به دانه‌های کیتین متصل شد و توانایی اتصال پروتئین‌های همجوشی Cts1 N ترمینال را تأیید کرد.
کمی کردن شدت سیگنال نشان داد که 44 درصد از پروتئین نوترکیب Cts1 و 68 درصد از پروتئین همجوشی Gus-Cts1 روی مهره گرفته شده است. عملکرد پروتئین فیوژن پس از بیحرکتی (روی مهره ها) مورد بررسی قرار گرفت. به طور خاص، فعالیت Gus بر روی مهره‌های انکوبه‌شده با عصاره‌های سلولی حاوی Gus-Cts1 تشخیص داده شد، که حاکی از حفظ فعالیت عملکردی (آنزیمی) علی‌رغم بیحرکتی روی مهره‌ها است.
در نهایت، سنجش ساندویچ ایمونوسوربنت بر روی صفحات الایزا و دانه‌های کیتین برای ارزیابی قابلیت VHH انجام شد.EE-Cts1 و VHHEپروتئین های همجوشی نانوبادی Cts1. Sy68/15-Jps1 کنترل در هر دو سنجش بود، با توجه به اینکه باید در ELISA فعالیت نشان دهد اما روی دانه‌های کیتین نه. پروتئین‌های فیوژن خالص روی صفحات ELISA پوشانده شدند، با RBD نوترکیب رقیق‌شده به‌صورت سریالی انکوبه شدند و توسط یک آنتی‌بادی ضد RBD و یک مزدوج ترب کوهی پراکسیداز (HRP) شناسایی شدند.
در حالی که هر سه پروتئین همجوشی نانوجسمی توانستند RBD را در صفحات ELISA جذب کنند، تنها Sy68/15-Jps1 و VHHEE-Cts1 فعالیت حجمی را برای رقت های سریال RBD نشان داد. VHHEE-Cts1 قویترین رویداد اتصال را در کمترین غلظت RBD نشان داد. دانه های کیتین به طور جداگانه با سه پروتئین همجوشی نانوبادی انکوبه شدند و با RBD مخلوط شدند. هر دو VHHEE-Cts1 و VHHE-Cts1 فعالیت اتصال را حفظ کرد، در حالی که Sy68/15-Jps1 فاقد فعالیت بر روی دانه های کیتین بود. مانند یافته های قبلی، VHHEE-Cts1 فعالیت قوی‌تری دو برابر بیشتر از VHH نشان دادE-Cts1.
توانایی جذب RBD این سیستم تشخیص مبتنی بر کیتین با تعیین فعالیت اتصال حجمی با استفاده از قویترین پروتئین همجوشی نانوجسمی (VHH) مشخص شد.EE-Cts1). دانه های کیتین با VHH بارگذاری شدندEE-Cts1 و با RBD نوترکیب رقیق شده سریال انکوبه شد. فعالیت با یک ساندویچ آنتی بادی تجاری شناسایی شد. محققان یک واکنش رنگ سنجی را در عرض دو دقیقه مشاهده کردند که شدت آن متناسب با غلظت RBD بود.
نتیجه گیری
به طور خلاصه، این مطالعه به ترشح نانوبادی های تک و دو ظرفیتی با واسطه Cts1 در برابر SARS-CoV-2 دست یافت. این یک اصل اثبات برای آزمایش آنتی ژن SARS-CoV-2 بر اساس کیتین ارائه کرد که توسط مکانیسم ترشح غیر متعارف Cts1 در U. maydis. نویسندگان کاربرد پروتئین‌های همجوشی nanobody-Cts1 را در تشخیص و خنثی‌سازی ویروس تأیید کردند. in vivo. این تایید کرد که نانو جسم می تواند به ویروس عفونی، علاوه بر سنبله RBD، متصل شود. نویسندگان بر این باورند که این استراتژی می تواند به یک روش آزمایشگاهی روی تراشه برای آزمایش آنتی ژن SARS-CoV-2 تبدیل شود.
*تذکر مهم
bioRxiv گزارش‌های علمی مقدماتی را منتشر می‌کند که توسط همتایان بررسی نمی‌شوند و بنابراین، نباید به‌عنوان نتیجه‌گیری، راهنمای عمل بالینی/رفتار مرتبط با سلامتی در نظر گرفته شوند یا به عنوان اطلاعات ثابت در نظر گرفته شوند.