ویژگی‌های بیوفیزیکی کلیدی واکسن RNA ویروسی خودتقویت‌شونده برای SARS-CoV-2


در مطالعه اخیر ارسال شده به bioRxiv* سرور پیش از چاپ، محققان از تکنیک‌های مختلف توصیف تحلیلی برای تعیین ویژگی‌های بیوفیزیکی واکسن اسید ریبونوکلئیک ویروسی خودتقویت‌شونده امپریال کالج لندن (IMP-1) که برای سندرم حاد تنفسی کروناویروس 2 (SARS-CoV-2) ساخته شده است، استفاده کردند.

مطالعه: توصیف بیوفیزیکی ساختار یک واکسن خودتقویت شونده SARS-CoV-2 - RNA (saRNA).  اعتبار تصویر: Andreas Prott/Shutterstock
مطالعه: توصیف بیوفیزیکی ساختار یک واکسن خودتقویت شونده SARS-CoV-2 – RNA (saRNA). اعتبار تصویر: Andreas Prott/Shutterstock

زمینه

از زمان شروع همه‌گیری بیماری کروناویروس 2019 (COVID-19) در اواخر سال 2019، فناوری واکسن، به‌ویژه توسعه واکسن RNA پیام‌رسان، در تلاش برای کاهش شدت و انتقال عفونت‌های SARS-CoV-2 پیشرفت چشمگیری داشته است.

واکسن‌های RNA خودتقویت‌شونده (sa) پیشرفتی نسبت به واکسن‌های mRNA هستند، زیرا همانندسازی خودتقویت‌شونده به ماشین سلول میزبان اجازه می‌دهد تا چندین نسخه از RNA آنتی ژن هدف بسازد. در حالی که این مزیت تجویز دوزهای 10 تا 100 برابری کمتر واکسن را فراهم می کند، کد خودتقویت کننده واکسن را حجیم تر از واکسن های mRNA معمولی می کند.

مزایای واکسن های RNA در سهولت طراحی، ساخت یا تغییر آنها نهفته است. فرآیند تولید واکسن mRNA شامل مراحل مختلفی است که از این مرحله شروع می شود درونکشتگاهی رونویسی مولکول RNA و پیشرفت به سمت خالص سازی و کپسوله سازی در یک نانوذره لیپیدی. هر مرحله از فرآیند شامل معرف‌های مختلف و چندین فرآیند فرعی است و کوچک‌ترین خطا در هر یک از آنها می‌تواند منجر به واکسن ناکارآمد یا ناقص شود.

بنابراین، توصیف تحلیلی و کنترل کیفیت برای تولید واکسن‌های mRNA موثر ضروری است.

در مورد مطالعه

در مطالعه حاضر، محققان از طیف‌سنجی فرابنفش (UV)، پراکندگی زاویه کوچک بیولوژیکی (BioSAXS)، پراکندگی نور دینامیک (DLS) و دورنگی دایره‌ای (CD) برای توصیف ویژگی‌های بیوفیزیکی IMP-1 استفاده کردند. این واکسن saRNA شامل یک کد ژنتیکی برای پروتئین اسپایک SARS-CoV-2 تثبیت شده و یک کپی ویروس آنسفالیت اسبی ونزوئلا (VEEV) است.

mRNA IMP-1 رونویسی شد درونکشتگاهی، خالص شده و با استفاده از فیلتراسیون جریان مماسی و کروماتوگرافی تغلیظ شد. خلوص و غلظت mRNA IMP-1 با استفاده از A ارزیابی شد260/280 سنجش طیف سنجی UV. نسبت بین جذب 260 و 280 نانومتر برای تعیین خلوص RNA استفاده می شود و نسبت های کمتر از دو نشان دهنده آلودگی پروتئینی است.

سپس محققان DLS را انجام دادند، یک روش پراکندگی نور مبتنی بر محلول برای تعیین چندپراکندگی و اندازه مولکول‌های RNA در سدیم سیترات یا بافر فسفات سدیم. RNA IMP-1 در سیترات سدیم نیز در آزمایش‌های BioSAXS برای تعیین اندازه و شکل RNA مورد استفاده قرار گرفت. BioSAXS فرآیندی با توان عملیاتی بالا است که به مقادیر بسیار کمی از نمونه‌های خالص نیاز دارد و می‌تواند با استفاده از اشعه ایکس خانگی یا تجهیزات سینکروترون آفلاین انجام شود.

در نهایت، CD روی RNA در بافر فسفات سدیم و آب برای درک ساختار و کایرالیته یا ترکیب مولکول RNA انجام شد. طیف سی دی با استفاده از اسپکتروفتومتر با استفاده از محدوده طول موج 320 تا 180 نانومتر اندازه گیری شد.

نتایج

نتایج نشان داد که مولکول RNA IMP-1 شامل 11551 جفت باز و وزن 3.71 MDa است. طیف سنجی UV A260/280 نسبت 2.18 بود که نشان می دهد RNA فاقد آلاینده پروتئینی است.

آزمایش‌های DLS و BioSAXS قطر مولکول RNA را 873.63 Å تعیین کردند. روش DLS بر روی دو بافر مختلف انجام شد، و میانگین قطر Z و شاخص پراکندگی (PDI) برای RNA کمی اما به طور قابل توجهی برای هر دو بافر متفاوت بود، که نشان می‌دهد نوع بافر، قدرت یونی و pH بر اندازه RNA تأثیر می‌گذارد.

طیف CD، که ویژگی‌های ساختاری و ساختاری مولکول RNA را نشان می‌دهد، یک مارپیچ RNA شکل A در سمت راست و برهم‌کنش‌های انباشته در مولکول RNA IMP-1 را نشان می‌دهد. طیف‌های اندازه‌گیری با استفاده از آب سیگنال مارپیچی کوچک‌تری را نشان می‌دهد، که نشان می‌دهد، مانند DLS، نتایج CD به بافر وابسته است. به عنوان یک تکنیک تحلیلی، CD برای مشاهده اثر بافر، pH، دما، دناتورانت‌ها و نمک‌ها بر ساختار و ترکیب RNA بسیار مفید است.

نویسندگان همچنین چالش‌های موجود در تحویل مولکول‌های mRNA با بار منفی و استفاده از کپسوله‌سازی نانوذرات لیپیدی برای تثبیت و تحویل مؤثر واکسن را مورد بحث قرار دادند.

نتیجه گیری

به طور خلاصه، این مطالعه تکنیک‌های مختلف توصیف تحلیلی را برای مطالعه خلوص، اندازه، پراکندگی چندگانه، ساختار و ترکیب مولکول mRNA IMP-1 رونویسی شده از پلاسمید حامل کد ژنتیکی پروتئین SARS-CoV-2 و یک کپی VEEV مورد بررسی قرار داد. .

تکنیک‌های طیف‌سنجی UV، DLS، BioSAXS و CD که در این مطالعه بررسی شدند، اطلاعات ارزشمندی در مورد غلظت، اندازه، شکل و ساختار مولکول RNA ارائه کردند. این مطالعه همچنین اثرات بافر، pH و قدرت یونی را بر ساختار RNA نشان داد. نویسندگان بر این باورند که تکنیک‌های اضافی مانند کالری‌سنجی اسکن تفاضلی و پراکندگی نوترون با زاویه کوچک می‌توانند ترمودینامیک، پایداری و ساختار مولکول RNA را در دماهای فیزیولوژیکی مربوطه درک کنند.

*تذکر مهم

bioRxiv گزارش‌های علمی مقدماتی را منتشر می‌کند که توسط همتایان بررسی نمی‌شوند و بنابراین، نباید به‌عنوان نتیجه‌گیری، راهنمای عمل بالینی/رفتار مرتبط با سلامتی در نظر گرفته شوند یا به عنوان اطلاعات ثابت در نظر گرفته شوند.



منبع